提到ELISA實驗，相信大家都非常熟悉。盡管ELISA實驗操作相對簡單，但在實驗中總會遇到或多或少的問題，導致實驗進展受阻，給實驗者帶來不少困擾。那么給大家介紹一下ELISA實驗影響因素，希望能夠為您的ELISA實驗順利進行保駕護航。

1、樣本因素

內(nèi)源性影響因素

大約40%的人血清樣本中含有非特異性干擾物質(zhì)，可以不同程度影響檢測結(jié)果，導致出現(xiàn)假陽性或假陰性的結(jié)果。常見的干擾物質(zhì)有：類風濕因子、補體、交叉反應物質(zhì)和異嗜性抗體等其他物質(zhì)等。以類風濕因子和補體為例。

類風濕因子

在類風濕患者及正常人血清中，常含有較高或不同濃度的類風濕因子(RF)，其一般為IgM型，亦有IgG和IgA型，具有與變性IgG產(chǎn)生非特異結(jié)合的特點，因為在ELISA測定中，其可與固相上包被的特異抗體IgG以及隨后加入的酶標的特異抗體IgG結(jié)合，從而出現(xiàn)假陽性結(jié)果。

補體

在固相酶免疫測定中，來自哺乳動物的固相抗體和酶標二抗均有ji活人補體系統(tǒng)的功能。一方面，固相抗體和酶標二抗可因其吸附及結(jié)合過程中抗體分子發(fā)生變構(gòu)，使Fc段的補體C1q結(jié)合點暴露出來，使C1q成為一個中介物將二者交聯(lián)起來出現(xiàn)假陽性結(jié)果。另一方面，固相抗體也會因為活化補體的結(jié)合，封閉抗體和抗原的表位結(jié)合能力而引起假陰性。

外源性影響因素

樣本溶血

溶血樣本及混有紅細胞的血清采用ELISA法檢測易產(chǎn)生假陽性，這是由于溶血樣本中含有大量過氧化酶物質(zhì)（紅細胞或血紅蛋白中的亞鐵血紅素），在洗滌過程中往往難以完全洗脫，它可使H2O2釋放出原生態(tài)氧(O)，從而催化底物四甲基聯(lián)苯胺生成可溶性的有色物質(zhì)，即顯藍色，產(chǎn)生假陽性。所以嚴重溶血樣本不推薦使用。

樣本受細菌污染

因菌體中可能含有內(nèi)源性辣根過氧化物酶，因此，被細菌污染的樣本同溶血樣本一樣，亦可產(chǎn)生非特異性顯色而出現(xiàn)假陽性而干擾測定結(jié)果。

樣本保存不當

樣本保存時間過長可能因蛋白降解或變性而導致實驗結(jié)果偏差，為克服上述干擾，ELISA測定的樣本宜為新鮮采集。如不能立即測定，1周內(nèi)測定的樣本可存放于4℃，1周后測定的樣本應分裝低溫凍存。樣本推薦按使用量分裝以避免反復凍融，反復凍融也會導致蛋白降解或變性。凍存后融解的樣本，蛋白質(zhì)局部濃縮，分布不均，應充分混合后再測定，但混勻時應輕柔，不可強烈振蕩。

抗凝劑的干擾

肝素抗凝血漿會增加OD值，EDTA、酶抑制劑（如NaN3）可抑制ELISA系統(tǒng)中辣根過氧化物酶活性。

樣本脂肪含量過高

樣本中的脂肪含量過高，會干擾抗原抗體反應，造成假陰性。通過冷凍高速離心處理后，高脂樣本會分層，取樣時應避免吸取上層脂肪層，取中間澄清段進行檢測。

樣本的制備

樣本的收集時間、處理方法和保存方式都會影響ELISA實驗的結(jié)果。整理了樣本處理方法，供研究者參考。

酶聯(lián)免疫吸附測定實驗（ELISA)常見樣本處理方法

http://www.cloud-clone.cn/topic/201804271043087152.html

酶聯(lián)免疫吸附測定實驗（ELISA)特殊樣本處理方法

http://www.cloud-clone.cn/topic/201805141347467275.html

2、試劑因素

抗體的純度、親和力、滴度和特異性
抗體是ELISA測定重要的原料之一，抗體的品質(zhì)決定著ELISA測定的準確性。選擇純度高、親和力強及特異性強的抗體，可以有效提高試劑盒的靈敏度和特異性，且能保障檢測的準確性。


標準品定值的準確性
標準品定值是定量ELISA測定關(guān)鍵的因素之一，其中標準品定值的準確性決定了ELISA定量測定的準確性。需選用純度高，穩(wěn)定性好的抗原物，并準確定量，以確保ELISA定量測定的有效性。


標記物的活性
ELISA反應中常用到酶標記物、生物素標記物或熒光標記物等。受檢樣本中靶物質(zhì)的量與固相載體上標記物的量呈正比例或反比例關(guān)系，根據(jù)信號值（酶催化有色產(chǎn)物呈色深淺或熒光信號）進行定性或定量分析。標記物的活性，可放大反應效果，從而提高ELISA測定的靈敏度。