雙抗性TOPO載體的設計缺點遠大于優(yōu)點

Amp氨芐/Kana卡那雙抗性TOPO載體的歷史

20年前，市場上第一代商品化topo載體是invitrogen購買了專利license開發(fā)的，其中最著名的topo載體pCR 2.1-TOPO，這是雙抗性的topo載體。在中國TA克隆市場占有率極高的是Promega的pGEM T載體和Takara的pMD 18 T載體，這些載體采用傳統(tǒng)T4連接酶連接，全部是Amp單抗性。從理論上說， Topo異構酶原理的TOPO載體并沒有要求在技術上必須做成雙抗性的才能使用。完全可以做單抗性的TOPO載體。市場上目前絕大部分的載體都是單抗性的， 就已經說明，雙抗性只是在一個很狹窄的范圍內有少量需求，甚至很多同學在做克隆連接的時候就沒有碰到過要雙抗性的情況

1.為什么invitrogen當時設計Amp氨芐/Kana卡那雙抗性TOPO載體？

做為普通的PCR產物克隆載體，是完全用不到雙抗性的，既往幾乎所有廠家的T載體/平末端克隆載體，都是單抗性的（雙抗性完全沒有技術門檻，只要在質粒里面添加一個卡那抗性基因就可以）。但是為什么invitrogen特立獨行設計雙抗性TOPO載體呢？ 推測原因可能是invitrogen的載體系統(tǒng)很多，其中著名的gateway系統(tǒng)里面有很多載體是Amp抗性和kana抗性的?？赡転榱朔奖阍谶@個系統(tǒng)中通用，所以設計了雙抗性。只是適合自身情況才設計的。

下圖為invitrogen的雙抗性設計的載體

2. Amp氨芐/Kana卡那雙抗性TOPO載體的缺點

雙抗性設計，增加插入了卡納抗性序列，載體大小至少增加了1kb左右，造成兩個缺點：

（1）載體可連接片段更短

TOPO載體和傳統(tǒng)TA克隆載體不同，載體與可容納的插入片段是成反比的。雙抗性TOPO載體比單抗性TOPO載體大了一倍多，大的載體能容納連接的片段比小的載體短一些。也就是說單抗性載體能連接更長的片段。

（2）轉化子數(shù)量效率更低

連接完的質粒，要轉化感受態(tài)細胞，質粒大小和轉化效率成反比，而且是指數(shù)級的反比，也就是越小的片段越容易轉化進入感受態(tài)細胞，轉化效率大大高于大質粒。

3.卡那Kana抗性的優(yōu)點和缺點

（1）優(yōu)點：卡納抗性一般不會長衛(wèi)星菌落

Amp抗性生長久了， 容易長衛(wèi)星菌落， 但是只要控制時間， 及時把生長好的板子放進4度冰箱保存，就可以避免這個問題

（2）缺點：復蘇時間比Amp抗性復蘇要長1個小時

轉化后，卡那Kana抗性至少需要復蘇1個小時，Amp抗性最快可以不復蘇（不用做加LB培養(yǎng)液的復蘇步驟）

4.Aidlab：新一代TOPO載體技術的首創(chuàng)者和leader

1.采用了Amp氨芐單抗性設計

去掉Kana卡那抗性序列，縮短了1kb，全長基本就是復制子+Amp抗性，綜合起來全長僅1.85kb。是目前國內最小的TOPO載體。

2.Aidlab的TOPO載體能連接的片段更長，同等條件下，連接效率轉化子數(shù)量是一般公司的10-100倍

3.復蘇時間可以短到0分鐘

11年前Aidlab的 TOPO克隆載體技術早已處于領先水平，Aidlab的新一代單抗性TOPO載體任何一個指標都遠超對手！